רמות המבנה של חלבון:

1. מבנה ראשוני:

   • קשר פפטידי של מספר חומצות אמינו (נבנה בריבוזום)

2. מבנה שניוני:

   • צורת הקיפול של החלבון: אלפא הליקס או בטא שיטס (חלבון יכול להכיל גם וגם). נקבע לפי השיירים החופשיים שבהם מידע שמכווין את הקיפול.
   • אלפא הליקס:
     • מחוזק ע"י קשרי מימן
     • קשרי מימן נוצרים בין החמצן של קצה קרבוקסילי למימן בקצה האמיני של החומצה הרביעית שאחריו
     • סיבוב אחד של הסליל = 3.6 חומצות אמינו
     • אורך סיבוב אחד = 5.4 אנגסטרם
   • בטא שיטס:
     • מבנה דמוי זיג זג המיוצב על ידי קשרי מימן בין הסיבים, מתחלק לשני סוגים:
       • מקבילי - parallel:
         • השיריים נמצאים באלכסון ורחוקים יותר אחד מהשני בהשוואה לאנטי מקבילי
         • החיבור נעשה תמיד מהקצה האמיני לקרבוקסילי - המשטחים מחוברים עם לופים (ארוכים יותר מבטא טורנס)
         • לדוגמא:
           
       • אנטי מקבילי - Anti parallel:
         • השיירים שיוצרים את קשרי המימן מסודרים יותר ולכן המבנה יותר חזק ויציב
         • החיבור בין הקצה האמיני לקרבוקסילי מתבצע באמצעות בטא טורנס
           

3. מבנה שלישוני:

   • קיפול תלת מימדי של פולי - פפטיד, על ידי קשרים דיסולפידים (ציסטאין).
   • מתחלק לשתי קבוצות עיקריות של חלבונים:
     1. פקעתיים:
        • חלבונים גלובולרים, שרשראות פולי פפטידיות שיוצרים צורה גלובולרית
        • מסיסים במים
     2. סיביים:
        • חלבונים סיביים, שרשראות פוליפפטידיות שיוצרות רצועות ארוכות
        • לא מסיסות במים

4. מבנה רבעוני:

   • קשר בין מספר יחידות

דנטורציה:

• איבוד המבנה המרחבי של החלבון, שגורם לאיבוד הפונקציה
• גורמים לדנטורציה:
  1. חום: משפיע על אינטרקציות חלשות כמו קשרי מימן
  2. שינוי ממסים: כגון אוריאה (urea) שמשנים את הערכות קשרי המימן
  3. ריאגנטים מחזרים: אשר שוברים את קשרי ה S-S (קשרים דיסולפידים אשר נוצרים באמצעות ציסטאין)
  4. ערך PH קיצוני

• ניסוי אניפנסן:
  • אנפינסן גילה שאם לוקחים חלבון שעובר דנטורציה, וקודם מוציאים את האוריאה ורק אז מחמצנים (ביטול השפעת ריאגנט מחזר), אפשר לגרום לרנטורציה ב- 90%.
  • לעומת זאת, סדר פעולות הפוך (חמצון ואז הוצאת האוריאה) גורמת ליצירה רנדומלית של קשרים דיסולפידים ולכן לא יתקבל מבנה נכון, רמת הרנטורציה תהיה 1-2%

שיטות ריצוף חלבון:

• ריאגנט סנגר:
  • ריאגנט שנקשר לקצה האמיני של החומצה הראשונה בשרשרת. ניתן להוסיף HCL שמפרק את כל הקשרים הפפטידים וכך יותר קל לזהות את החומצה הראשונה שמחוברת לריאגנט.

• ריאגנט אדמן:

  • פעולה דומה לריאגנט סנגר. ההבדל הוא שריאגנט אדמן מפרק את החומצה הראשונה בעצמו. כך אפשר להשתמש בו שוב ושוב כדי לרצף את החלבון
  • אפקטיביות הריאגנט פוסקת לאחר בערך 30 חומצות אמינו

• פרוטאזות:

  • אנזימים שמפרקים קשרים פפטידים:
    • טריפסין (Trypsin): חותך אחרי Lys או Arg
    • כימוטריפסין (chymotrypsin): חותך אחרי Trp , Phe או Tyr
    • פפסין (pepsin): חיתוך לפני Phe
    • ציאנוגן ברומיד (cyanogen bromid): חיתוך אחרי Met
  • הפירוק של פפטידים ארוכים לכמה פפטידים קצרים אומר שנוכל להשתמש בריאגנט אדמן

• ספקטרומטריות מסה:

  • חותכים חלבון למספר פפטידים ומייננים אותם. את הפפטידים המיוננים מאיצים במכשיר במעל מגנט
  • פפטידים בעלי מסה גבוהה יותר קיבלו יותר מטען ולכן לא יוסטו ממסלולם באמצעות המגנט
  • נוצר מצב שבו לכל פפטיד במסה שונה יש מסלול משלו וכך ניתן לרצף כמה מכל פפטיד היה בחלבון

• דף sds:

  • שיטה נוספת לחלוקה לפי מסה
  • לאחר דנטורציה, מולקולות של sds (טעון שלילית) מתחברות לחלבונים.
  • את החלבונים שמים בג'ל שטעון חיובית בקצה אחד ושלילית בשני
  • המולקולות הארוכות יותר (יותר מסה) יעברו ביותר קושי בג'ל ויקח להם יותר זמן להגיע לקצה. מכך נוצרת הפרדה לפי מסה (נקרא גם Bands)
  • גם אם יש מוטציה בחלבון, כל עוד החלבון נשאר בערך באותו משקל (בין אם חומצת האמינו שהוחלפה היא באותו משקל או שכמות החומצות שהוחלפו היא זניחה), ה Band ישאר באותו מקום.